百合必lilium植物亲缘关系及通江百合l.sargentiae遗传多样性研究-study on the genetic relationship of lilium longiflorum and the genetic diversity of l sargent iae of lilium longiflorum in tongjiang.docx
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西南大学博士学位论文百合必（Lilium）植物亲缘关系及通江百合（L.sargentiae）遗传多样性研究姓名：智丽申请学位级别：博士专业：园艺学（花卉学）指导教师：李名扬20111202摘要百合属上讲既优植物亲缘关系及通江百合上．s仃曙P刀砌遗传多样性研究园艺学(花卉学)博士研究生 作者姓名智丽 指导教师李名扬教授摘要百合属由LiIlllaeus于1753年建立，是一个北温带的属，北半球广泛分布。自1836年 Endlicher最早对百合属属下类群进行划分开始，百合属的分类争议从未停止过，著名学者 Baker、Wilson等都曾对百合属下类群划分提出过自己的观点，他们的观点因存在争议并未被 广泛认可，直至1949年Comber依据15个形态特征建立了百合属的分类系统，此系统一度被 大多数学者所接受并延用至今。系统学兴起后，研究者曾对日本、朝鲜等区域的百合属 植物进行过系统发育研究，他们的部分研究结果与Comber的系统不完全相同，其中围绕毛百 合、湖北百合的系统，卷瓣组的设立等问题的争议较多。中国是百合属的分布中心之一， 百合属植物在中国分布区内发生着强烈的分化，而针对中国范围内百合属植物的较为全面的 系统学研究几乎从未开展过，已有的研究只是针对部分区域范围内的百合资源遗传多样 性或部分野生种与栽培种的亲缘关系等进行过探索。利用新兴的技术较为全面的研究我国百 合属原生种的亲缘关系对于解决目前百合属下类群划分的一些热点问题是有借鉴意义的，也 是十分必要的。而了解我国百合原生种的资源特点对于资源合理利用、发展花卉产业也是十 分迫切的。本文主要以收集到的百合属23种2变种为试材，采用s黜”和AFLP两种标记技术 研究了野生百合种的亲缘关系，探讨了有关百合属下类群划分的几个有争议的问题。同 时，针对重庆范围内通江百合资源相对较为丰富的特点，采用S凡垤标记技术分析了lO个居 群的遗传多样性和居群遗传结构，提出了种质资源利用与。主要的研究结果如下：l百合属植物遗传多样性丰富，种间差异明显，遗传基础广． 采用sRAP和AFLP两种标记技术分析了我国百合23个原生种，2变种共25份种质西南大学博士学位论文的遗传多样性。19对sRAP引物对23份供试材料的基因组DNA进行扩增，共得到清晰条带 236条，多态性条带233条，多态性条带比率为98．72％，遗传相似系数变化范围为O．3750～0．7679。8对AFLP引物组合对百合属植物25份材料共扩增出条带395条，其中多态性条带368条，平均多态性条带比率为93．12％，8对引物的多态性条带比率都在90％以上，百合属内 相似系数的变化范围为O．4417～O．8126。两种标记的结果都显示我国百合资源遗传多样性丰 富，种间差异明显，基因资源丰富。2系统学研究结果与形态分类结果部分吻合． 基于SRAP和AFLP两种标记技术共得到2份系统发育与亲缘关系树状图，与百合属形态分类观点部分吻合。SRAP和AFLP分析得到的轮叶组、百合组聚类结果与形态分类观点大致相符， S凡廿聚类结果显示轮叶组种质虽然聚在了一起，但并不是自成一支。卷瓣组 分成了几个支系。毛百合与卷丹聚在一起，未成一支，也没同钟花组其他种质聚在一起。 AFLP聚类结果与我国传统分类观点大致相符，供试25份种质被分成了4组，轮叶组和百合 组种质聚类结果与传统形态分类结果大部分吻合，卷瓣组，钟花组聚类结果与传统分类观点 不尽相同。两种标记的聚类分析说明虽然依据形态性状可以将百合属植物分开，可以进行属 下类群划分，但是我们研究结果同时也，单纯依据形态特征的分类是有争议的，因为有 些种虽然形态特征相似但是其亲缘关系却很远，比如湖北百合与南川百合等。3卷瓣组的组成成分复杂，组内分化强烈。卷瓣组以花冠不为钟型，花被片反卷，雄蕊向四周张开而与其它组明显分开。本研究分 析了百合属卷瓣组11种2变种13份种质，各种质间除具上述共性之外，在花色，花瓣基部流 苏状突起的有无、叶型、节间长度，植株高矮等形态特征上差别明显。SRAP聚类结果表明除 湖北百合外，余下10种分别于III、IV类群下聚成3支。AFLP聚类结果也显示除湖北百合外， 余下的lO种2变种在II、III类下聚成不同支系，两种标记的聚类结果都显示卷瓣组的种质未 能聚成的一类，而是分成了几个亚类群，说明卷瓣组组内分化强烈，是个非常复杂的组， 可能为多元起源。4湖北百合与百合组亲缘关系较近。Comber认为湖北百合与南川百合外部形态特征相似，将二者都划在了卷瓣组下，本研究 两种标记的聚类结果均显示，湖北百合未能与卷瓣组种质聚在一起，而是与百合组的种 质聚成一支，说明湖北百合与百合组(喇叭花组)亲缘关系较近，尤其是与百合组下的岷江 百合亚组亲缘关系较近，而与卷瓣组亲缘关系较远。5卷瓣组与钟花组存在基因交流。《中国植物志》中卷瓣组和钟花组各自为的组，两组种质在花型上差异明显，但本研II摘要究显示，无论是SRAP标记还是AFLP标记都未能将两组完全分开，卷瓣组的部分种质，尤其 是卷丹常和钟花组种质聚在一起，说明两组之间存在基因交流和渗透。6青岛百合与东北百合亲缘关系较近。 青岛百合与东北百合均为轮生叶序，花具斑点，在本研究基于SRAP和AFLP标记分析的聚类图中，两者都聚在了一起，说明两者亲缘关系较近，同时也表明传统分类中把二者划归入同一组的正确性。 7毛百合系统复杂。Comber把毛百合列在了单种组毛百合组内，我国传统分类观点认为毛百合与渥丹形态特 征相似，所以把二者归入钟花组，表明毛百合的系统是有争议的。本研究显示基于S＆廿 的聚类结果，毛百合没有和钟花组的玫红百合、渥丹百合聚在一起，基于AFLP的聚类结果 显示，毛百合和钟花组的其它种质聚在一起，进一步验证了毛百合的系统的不确定性， 需要进一步的研究、探索。8通江百合遗传多样性丰富，居群内变异大于居群间变异。15对SRAP引物对通江百合重庆分布区内lO个居群的100个样品的基因组D1妊扩增结 果表明，通江百合在百合属中群体水平和水平上的遗传多样性均较丰富，居群水平的遗 传多样性高于其他的单子叶植物。异花传粉、无性繁殖系数低可能是通江百合遗传多样性高 于其他单子叶植物的主要原因。通江百合居群内变异大于居群间变异。通江百合居群发生了 较大程度的遗传变异，居群间遗传分化系数函r为0．3672，高于单子叶植物平均分化系数(白卢0．2310)和多年生草本植物的平均分化系数(白间．2330)。异交，基因流受阻、地理阻隔作用和较小的种群规模是是导致通江百合产生遗传分化的主要原因。关键词：百合属；亲缘关系；通江百合；遗传多样性III两南大学博士学位论文ⅣAbstractSmdy on phylogenetic relationshipof the genus三Z7Z彩聊and genetic diVersity of L．sQrgenticlePh．D Candidate：ZhiLi Superisor：Li Ming—yangAbstractTlle genus三讲删，es讪lished by Lm删s iIl 1753，w觞widely di矧buted iIl the No陆em Hemisphere．The disputes ha、，e never stopped s访ce Endlicher earliest proposed the claSsincation (taXonomy) of廿le in行ageneric in 1836．Baker觚d Wilso玛知【IlouS scholar，put fon)l，ard views onthe cl舔sificatioll，which w鹤not uniVerSally acknowle起ed．h1 1 949，Comber established me cl船sification of the genus Lilium aCcordir塔t0廿le mo叩holo酉cal characteriStics，w11ich w器 auccepted by most of the scholars up t0 now．But some reSearchers’late resultS according t0systema=cic developmem were not idemical wim Comber’s，廿le main di毹rence waS the Systematicspos“ion of三．如w配删，L办缈少锄d Sect．跏俐硼缈刀．nle彤at di毹rentiation of三班堋occurred in Chill％where waS one of也e dis仃ibution center．ComprehensiVe molecular syStematics of三蹦姗f dis仃ibuted in China h舔not been r印orted．It is necessaD，to snJdy廿1e phylogenetic relatiollship t0 solVe me iIl丘agencric of the genllS三班加唧，also u唱em to utilize resources reaSonable and deVelop flower cunure indusny．23 lily wild species a11d 2 Varietyies were chosen f．0r t11e present study，t、^ro molecular markers， sequence-related锄plified polymo巾hism(SRAP)and amplified行agment lengttl polymorpmsm (AFLP)，were used t0 probe廿le耐iageneric phylogenetic relatioIlsllip and me claSsification of 三肼z口竹．The population genetic diVersi够and genetic stmcture of￡．s口，g口拧f尬P were analyzed in View of rich resources iIl Chongqing，aIld resources utilization a11d protection were also proposed．ThenlaIn results were as f．oUows．1．The genus Lnium was rich in genetic diversi劬the difference was signi6cant onthe leVel of species，genetic f．oundation was extensive23 lily wild species，2洲eties were chosen to probe the infhgeneric phylogenetic relatiollship b弱ed on SRAP and AFLP DNA e羽racted f沁m 23 lily wild species w瓠PCR锄plified，and 1 9SRAP p打mer combinatioIls were used．A total of 236 clear DNA b纽ds were anlplified233 of which were polymorphic，me proportion w笛98．72％wi也average 1 2．3 p01ymorphic 10ci per sRAP州mercombination．111e genetic sim订撕ties mged舶m O．3750 to O．7679．DNA ex仃acted仔伽25 lilyV西南大学博士学位论文specjes w嬲PCR amplified，using 8 AFLP priIller combinationS，a to伽of 395 clear DNA bandswere锄plified，368 of、Ⅳhich were polymo叩hic，the aVerage proportion w嬲93．12％，the similarit)，index ranged行om O．44 1 7 to O．8 1 26．The two molecular markers showed仕lat tlle genetic diversi锣 w舔rich，the di彘rence w嬲signific觚t on the leVel of species，and gemlpl勰m waS rich in genus 上胁堋2 inChi眠2．MolecuIar systematics and morpholo酉cal classi6cation we心partially identicaI TW0 phylogenetic仃ees were com灯ucted based on two molecular markers．The resultS werepanially conSistem with mo印holo影claSsification．ne cl咄ring of Se瓯此唧n and Sect．三P凇D，加．D以w雏basically idemical wi廿l morphology c1舔sification based on SRAP and AFLP．SRAP dendr0黟锄showed that the gennpl雒ms of Sect．朋r口，幻g口n clustered together，Sect．&以D所口，t昭D玎 comprised a few clades，三．c如钟记z口打aIld L Z册c咖疗。册clustered to鲥her，separa把d with thegemplaSms of Sect．三础a叻D，-z打行．AFU?dendrog阳m showed mat tIle cluStering resultS weremoStly conSistI}nt wi也traditional taXc呱)my，four m萄0r clades including 25 species were delimited， Ⅱle cl呶硎ng resuItS of Sect．肋r口7吁日g口n and Sect．￡Pz圮D胁。幻甩were mostly consistent with仃{lditionaltaxonomy，whereas the clustering results of Sect．研疗D所仞姆刀and Sect．￡咖a叻D，Iz研z we他difrerent with t脚itional ta)【onomy．n demonstrated that it’s di师cuh t0 cl嬲si匆三f疗“聊only baSed on恤morphological ch删eristics，because phylogenetic relationShip waS distant despite matmo印hological ch锄ct酣Stics were siIIlil盯be呐een some species such舔L办阴形and上．脚历D聊纪3．The gemplasms Of Sect．跏D肌口rf碍g口甩were complex，the dif亿他ntiation wasgI．eat in the sectionSect．肋zDm蝴聆w笛ch撇rized by no bell·shaped coroll岛reVolute tepals，open staInen．Using 11 wild species锄d 2 Varieties of Sect．5锄Dm讲吮喀狮嬲m舢erial，廿le morphological characteriStics w雒锄alyzed，nower colo瓯丹inged outgrowm on the petal baSe，leaf够pe，缸emode lengnl锄d plant height were apparently di虢rent．SRAP dendrogram showed tIlat 3 clades iIlcludingl 0 species、^，ere delimited under group III andⅣexcept上．lzP”，∥．AFLP dendrogram also showed nlat 1 0 wild species觚d 2 Varieties were divided imo di仃erem clades under group II锄d III except三．^Pm少．T钾o molecular markerS showed tllat Sect．跏Dm讲7q弘刀genIlplaLsms、vere not cluStered int0one group，but diVided into di毹rem clades，it demons仃ated廿lat me di伍≥rentiation occurTed in Sect．＆”Dm口，翻暂铆，the origiIl of Sect．彤玎Dm口，铂gD胛could be muhielement．4．￡．厅删叼厦and Sect．上P比∞胁胁栉were the closely related systemsComber cl嬲sified三．厅P∽面觚d上．，琊历D聊豇int0 Sect．勋2Dm口厂心gD珂according t0 nleshil撕ty of也e morpholo舀cal ch删Stics．m也e pre9ent mldy t、Ⅳo Inolecul缸markIers showedthat三．JlzP，2，∥w弱not clus把red mo Sect．跏Dm田钥哥聊ge肌plaLsms，but clustered one clade int0 sect．三Pz彤D励呵D，z．n suggestedⅡlat三．^P唧f was closely related witIl Sect．LPl圮D咖f伽，especiallyVIAbStraCtwith上．强蒯P subsectioll柚d distantly related with Sect．跏om口，翻霉rD疗．5．Gene exchanges existed between Sect．工叩^印矗口，口，靠and Sect．．跏伽口—6口I{渺咒se“5锄D册口，叮铅D以and sect．厶啦6叻口，．a册were separa把Section i11‘‘FIom of china”becauSe of tlle印parem di行erence of flower sh印e．The resun showed t11at t、)l，o sectiollS ge咖lpaSms couldnot be diVided separately by t、Ⅳo molecul缸markerS dendrogram，it suggested mat gene exch锄geisted be铆een the t、)l，o sectiOns．6．L如恸甜删sP and三．D西纸哺“扰were the closely related systemsLeaVes of L豳功g幼绷P锄d厶D￡，矗cIizz肋were、)I，hor】ed，flowers were spotted，bo廿1 twophylogenetic臼ees showed that L细?馏纪“P珊P aIld三．D括硪哳跏werc clustered int0 one group，it sL唔gested that三．捃加g亿“P，坫P and L D括比办z册were也e closely related systems，which w嬲 identicaJ with mo印hology claSsification．7．Systematics position of￡．如比廊口肌was controVersialAlthou曲三．出眺删waS cl鹊sified into Sect．D口舢胁加which com州sed 0nly one spec溉by Comber，厶出“r纪踟锄d厶∞加D厶were classified mt0 Sect．三础哪D，z删，because morphological characteristics of上．如洲c￡删and三．∞栉∞Za，．were similar in仃aditional taxonomy iIl ChiIla The result showed nlat L db御话a聊w嬲not clustefed j11t0 one辱．0up with三．册2D￡栉z肼锄d厶cD刀cD肠r of Sect．三嘲9砷D，．堋0n tlle b鹬is of SRAP dendrogram，厶出；口话聊z w硒clustered into otIler gemlplaSms 0n廿le b丛is of AFLP dendrogram，Which proved nlat Syscematics position of L如z矿配z‘，咒is uncertain．8．L s口增删f谊P was I．ich in genetic diversi锣】OO wild Iily s锄pleS were conected丘Dm 1 O populatiollS，锄d 1 5 SRAP primer combinationS were uSed for detennination．The resultS showed tllat三．s口，gP甩f纽P waS rich iIl genetic diversi够0n tlle leVel of populatioIls锄d Species of genus三班￡册，the genetic diverSity within populatioIls exceeded otller monocot)，ledonous plaI】峪， 10w coe伍ciem of cross—pollination aIld aum reproduction might be廿le ma抽陀ason．High degree of v习Iriation of tlle population of三．s口，苫官，z纭韶0ccu盯ed，me V撕ation within populatiolls exceeded锄ong populations，the res仃aim of gene nowgeo掣Iaphy obs协Jcts and small population were the main reason of genctic diff．ercntiation m厶s田gemiae．Key words 三五聒h朋，phylogenetic relationship，L如馏册f缸P，Genetic diversi够VII阿南大学博-七学仲:论文VIII第一章文献综述第一章文献综述1．1百合属系统及资源分布1．1．1百合属系统及属特征 百合属姗l由C．Li加aeuS于1753年建立，为百合科三玎豇彤P册(狭义)百合族T曲．Lilie勰(做htaii孤，1980，1987)的一个多年生属。该属植物具多年生肉质鳞茎，鳞片肉质，卵形或披针形，白色，有节或无，花常具鲜艳色彩，有时具香味，单生或数多成总状花序。叶披针形， 散生，少轮生，花被片6，2轮排列，离生，有时反卷或强烈反卷，花冠钟形或喇叭形，雄蕊 6枚，花丝钻形，花药椭圆形，丁着药，子房圆柱状，花柱细长，柱头3裂、膨大，蒴果纵裂， 种子扁平具翅。1．1．2百合属资源分布百合属是一个北温带的属，在北半球广泛分布，全球约115种(傅立国，2002)，间断分 布于欧、亚和，主要分布于东亚和(梁松筠，1999)，如中国、日本、、美国 及欧洲部分地区。其亚洲分布区北起勘察加半岛(约北纬56。)和西伯利亚中部到叶尼河下游 (约北纬68。)，南至吕宋岛(约北纬17。)和印度南部(约北纬11。)。在东亚地区的百合种类 最为丰富，有57种，即包括了原始组也包含了进化组的，是百合属的多样化中心(梁松 筠，1999)，其中55种分布于中国，36种为我国特有(梁松筠，1995)。地区也是百合属 的多度中心之一，有30种，全部为所特有。1．2百合属系统学研究进展1．2．1百合属形态分类研究进展植物学家Endlicher于1 836年最早对百合属属下类群进行分类研究，他将百合属划分为5 个组，Sect彳肌6撕fI研、Sect．^缸，．砸gD咒、Sect．nP谢b胁玩聊、Sect．眈跏fI研、Sect．cc耽幻∥拥姗，其 中Sect．彳肌6，以册和Sect．Q黝铂c，．砌例后来被划分入其它属。 1 871年Baker依据花型特征对Endlicher的观点进行了更改，将百合属划分为4组，Sect．励胁由甩、Sect么砌P胁玉研、Sect．sD船矗明、sect．Il缸眈罾铆，后三组为新组。1925年，Wlson在对东亚百合研究的基础上，结 合花型、花药等特征，采纳了Baker的大部分观点，对该系统进行了进一步更改，将百合 属植物划分为四个组：即百合组Se魄屁船D胁幻胛，具叶柄组Sect．彳砌P胁仍刀、根茎组Sect．nP砌疗Hz册、轮叶组Sect．^幺腕礓聊。此后，Comber于1949年依据15个形态特征，提出了及具影响力的分类系统，将百合属分为7组9亚组，即轮叶组Sect．坳毗妒陀、根茎组Sen nP砌矗玎柳z、百合组Sect．三班z删、具叶柄组Sect．彳，c^PZ洲钟、卷瓣组Sect．S拥Dm口仲，?、喇 叭花组Sect．乜z脚·矗一D甩、毛百合组Sect．D口“阳跏fD玎，其中根茎组Sect．风P删z册、卷瓣组两南大学博+学位论文 Sect．S加D们硼咖孽硎、喇叭花组Sect．乜们D胁fD又被分别划分为4个、3个、2个亚组。此系统被大多数学者所接受并延用至今。此后Macheal依据百合形态特征和行为特征等18个特征，参照comber系统将百合属86种划分为7组，13个亚组。1968年li曲锣R w依据形态特征建 立了百合系统进化树。但是围绕百合属下类群划分、起源、进化和迁移等问题争议并未停止 过，此后很长时间百合属系统学研究多是建立在形态性状的基础上。如Bar觚ov“1988)结合花 器官、营养器官特征的系统学研究，As卸o(1986)对形态形状的数量分类、Smith等的染色体C 带研究等都试图对Comber系统中的有争议问题提供一个更加科学的解释。1．2．2百合属系统学研究进展1．2．2．1系统学兴起继Haeckel之后，人们一直试图通过树状图的方式体现类群之间的进化关系，构建能够体 现进化历程的系统树，经过数十年的研究、发展，直至1950年，Henning提出“系统发育系统 学”，主张通过性状的比较与统计分析，建立所研究类群的系统进化树，从而重建其进化历程， 此后分支分析被广泛用于系统发育问题研究。传统的分类学中，不同类群间尤其是不同种间 的划分主要是依据表型差异，除此以外，生物化学、解剖学、孢粉学、细胞学、胚胎学等都 是用于完善系统进化树的。基因变化一直以来被认为是生物进化的基础，二十世纪末，系统发育研究的重点已经开始转向DNA和RNA，从而产生了一门新兴的学科 ．系统学，由于系统学一贯注重核酸方面的数据，因此人们认为生物学数据更能体现基因的变化 水平，相对于表型数据而言，生生物学分析结果更加接近于类群的系统发育关系。对于 那些用形态性状无法确立系统关系的类群，利用性状常常能迎刃而解，给出它们的系统 (陈之端，2001)，尤其是在生物学和计算机技术快速发展的今天，人们在比较基因 序列差异、数据处理等方面的能力大幅提升，使得系统学的方法成为研究系统与进化的 常规手段。利用现代先进的生物学技术、手段来研究传统分类学问题，能更好的体现系 统与进化关系(Sin曲G2008)。系统学是在水平上对生物进行遗传多样性、分类、 系统发育与进化等方面的研究，其结果对于生物多样性，解释生物进化的机理，重建进 化历程十分重要。1．2．2．2系统学常用研究方法系统学是通过检测生物大包含的遗传信息，定量描述、分析这些信息在分类、 系统发育和进化上的意义，从而在水平上解释生物的多样性、系统发育及进化规律的一 门学科，它以生物学、系统学、遗传学、分类学和为理论基础，以生物学， 生物化学和仪器分析技术的最新发展为研究手段，是一门交叉性及强的学科(徐宏发，2001)。 根据研究方法的不同，系统学的发展大致可以分为2个阶段，第一阶段蛋白质水平的标 记与检测，20世纪50—60年代，系统学研究主要集中在蛋白质水平上，如同工酶、等位2第一章文献综述 酶电泳技术，蛋白质立体结构测定等；70年代开始进入核酸水平时期，90年代至今，发展到以聚合链式反应为基础的系列生物技术研究阶段，如核酸水平的标记与检测技术，通过测定核酸一级结构中核苷酸序列组成来比较同源之间相关性的核酸序列测定法等。 系统学研究方法之一首先是通过现代生物学技术获得特定遗传标记的大量数据，然后对数据进行相关的数学分析，对研究结果进行解释和说明。植物系统学研究的方法之一是对植物一定的核酸序列进行同源性比较，构建系统树，探讨研究类群间的系统演化关系。 目前应用于植物系统学研究的基因主要为核基因和叶绿体基因，常用的有叶绿体基因组 的m砌基因、rbcL基因、ndH基因、．ndF基因，核基因有核糖体18s、ITS序列，叶绿体 matK基因常用于科及科以下分类阶元的研究，rbcL基因广泛用于科以上及远缘属间的分类研 究，ndF基因在植物中进化速率较快，常用于属以上的系统学研究。18Sr DNA基因可用于目、 科、属等分类群间的系统发育研究，ITS序列适合于被子植物科内，近缘属间、种间乃至居群 间的亲缘关系分析。叶绿体基因结构上相对保守，进化缓慢，不同部位的进化速率不同，进 化构成中很少发生重排，因而常被用于系统发育研究，但叶绿体基因为单亲遗传，并不能解 释系统发育的所有问题，难于解决网状进化，进化速率上低于核基因组，不能体现间的 进化方向，因此他在较低等级的分类中很少应用。1．2．2．3百合属系统学研究进展早期的百合属研究多是基于形态性状的分类研究，直至1968年lighty R W依据形态特征 建立了体现系统发生的百合系统进化树，百合的系统发育研究刚刚起步。此后相当长时间百 合的系统发育研究进展缓慢，其间，Haw(1986)在多年研究的基础上提出，单纯依据形态特 征很难对百合属进行分类，因为有些种虽然亲缘关系较远但其形态特征尤其是花型特征却非常相似。也就是说单纯依据形态特征进行的系统发育研究已经开始受到人们的质疑。上世纪 末伴随着系统学的兴起，系统学的多种研究方法和手段已逐步应用于百合属的研究 中。研究者试图通过生物学技术和方法检验C0mber的系统，同时也希望能就Comber系 统中一些倍受争议的问题找到答案。现今普遍采用的分类系统是Comber于1949年依据15个 形态特征建立的，系统学兴起后，研究者采用多种方法对该系统进行评价、探究。Y锄agis嫩 M．(1995)和Kazuhisa等(1997)曾先后将RAPD和PcR-RELP等标记技术用于百合属下部分种或杂种的鉴分。Nisikam等(1999)最早对源自日本的55种百合、大百合(Q黝铂仃锄蝴艘册纪加晰)、及豹子花叫确D幽咖s砌把门P凇妞)的ITS变异序列开展研究。Dubouz“(1999)利用ITS变异序列分析方法对原产日本的16种l变种进行了系统发育研究。 Nisil【av忸(2001)采用ITS变异序列分析方法，针对百合属64个类群和2个近缘类群进行研 究，探讨了卷瓣组的系统进化问题。Lee(20l 1)在对朝鲜83种，14变种的研究中，也采用 了ITS变异序列分析方法。3两南大学博七学位论文1．2．3百合系统学研究热点问题C0mber的百合属分类系统自公布以来一直被普遍接受，至今仍广为应用，但对该系统的 探究、评价却一直在持续，随着人们对百合属研究的深入和新的技术手段的应用，争论、研 究的热点主要围绕以下几个方面：1．卷瓣组的设立是否正确，CoInber设立卷瓣组之初包含了22个种，广泛分布于东亚， 现今已发展为30种，这些种又被分为5a、5b、5c三个亚组，Te船rson．Brown和Howlalld(1995) 认为卷瓣组是个非常复杂的组，它包含了很多亲缘关系较远的种。Nisikawa等后来的(1999) 研究结果说明卷瓣组为多元起源。2．毛百合组能否为一个的单种组，Leslie(1982)曾经对毛百合组和卷瓣组的设立提 出；Nisil【awa(1999，2001)等研究认为毛百合组应被归并入卷瓣组。3．湖北百合的系统，Comber依据花部特征把湖北百合L厅P船，]一划入卷瓣组，但是 Leslie(1982)却依据种子生殖力把它纳入喇叭花组，后来研究者Nisikawa等(2001)、Hayaslli 等(2000)和Lee(201 1)等的研究结果也表明湖北卣合的系统存在争议。 1．3我国野生百合资源特点及研究进展1．3．1我国野生百合资源特点中国为百合属的自然分布中心之一，特有种类多，特有种分布范围广，生物多样性资源 丰富。我国原产百合55种(傅立国，2002)，占世界百合种类的近1／2，36个特有种。中国百 合资源不仅种类丰富，而且野生百合分布区域广，分布区域自然生境多变，变种和生态型较 多，不仅提供了丰富的育种亲本材料，也为生物多样性的形成奠定了良好的基础。野生百合 分布区覆盖全国27个省市(穆鼎，2005)，华中、华南、西北、东北、西南均可见其分布， 以西南地区种类最为丰富，有38种，有30个特有种(梁松筠，1999)。我国野生百合资源多 分布在高山与亚高山地区，海拔1 000m以上高山地区的种多达36种，主要在横断山脉的滇 西北与川西地区、秦岭、甘肃岷山、湖北神农架以及东北山区(中国科学院昆明植物 研究所，1997；四川植物志编辑委员会，1989；中国科学院西北植物研究所，1976)。低海 拔(低于1000m)分布的种较少，主要分布在华中及华东浅山丘陵地区。我国西南地区是世界百合属的多样化中心之一(安民，1999)，百合种质资源丰富，其中不乏小百合厶胛册z册、岷江百合三．础等珍贵资源。1．3．2我国野生百合资源研究现状中国百合资源及其丰富，《中国植物志》(1980)收录百合属植物4组39种，后相继有10 余新种发表(许介眉，1985；1986；汪发缵，等，1986，彭隆金，等，1986：张定成，等， 1991：祝正银，1993；马吉龙，等，2000)，致使中国原产数上升为55种。其中36种为 中国特有。中国丰富的野生百合资源曾经一度引起国外学者的关注，如wilson(1898)曾不远4第一章文献综述 万里实地考察过中国的野生百合资源，在此后发表的学术专著中，Wilson(1925)和Haw(1986)等都曾对中国百合做过特别评述，1986年英国学者S．G H锄以《中国植物志一百合科》为蓝本，出版了《中国的百合科植物》(111e lilies ofChina)，使国外学者更加深入全面地了解中国 的百合资源。国外在上世纪60年代末已开始野生百合资源的调查、收集和评价工作 (Diw锄，1995)，相比较而言，我们自主的百合研究起步较晚，开始于上世纪80年代的百合 研究主要体现在以下几个方面：1．3．2．1形态分类研究《中国植物志》(1980)将收录的39中百合划分为4组： 百合组sect．上玎fz册叶互生，喇叭花型，于花梗上横生，花被片先端外弯，雄蕊微上弯。包括有野百合三．6rDww豇、泸定百合三．墨口曙P”砌P、淡黄花百合三．s“f}砌“陀删、宜昌百合三．彪粥册历删、岷江百合、麝香百合厶砌磁伽，．珊z、百合三．力册∞册堋等。钟花组sect．三础9肋∥姗叶互生，花冠钟型，较百合组短，花朵向上，下垂或倾斜。雄蕊向中心靠拢。有渥丹三．∞甩∞厶9，、毛百合三．幽砒堋、玫红百合厶伽D册z册、滇百合Lbnken∞t埘帆等。卷瓣组Sect．跏伽甜啪花冠不为钟型，花被片强烈反卷，雄蕊上部向四方张开。卷瓣组包含的种类极多，种间在花色、株型、叶形等方面的区别较大。如川百合三．如v跏、大理百合三．纪如瑚P、卷丹￡．肠w咖疗堋、宝兴百合厶比幽酬地f、山丹三．P姗f如册、湖北百合L^饥，．∥、 南川百合三．肼历D惭打等。轮叶组Sect．拖腕硌弦聆叶轮生或近轮生，花具斑点，花朵向上或下垂，包括有青岛百合上．缸咖孽勉“阴sP、轮叶百合厶统，斑办z册等。13．2．2资源调查及引种驯化研究我国百合栽培历史至少有lloo年以上(龙雅宜等，1998)。以驯化为目的我国野生百合 种质资源收集工作始于上世纪80年代。80年代初，昆明植物园彭隆金等开始始对云南分布百 合进行广泛的引种驯化，选择适于作切花的野生资源(如：淡黄花百合与泸定百合，)进行部 分商品化栽培。东北林业大学张敦方、杨利平等(1997)先后开展了东北地区野生百合引种 栽培研究，研究了观赏价值较高的毛百合在自然在条件下的生长繁育、种子萌发行为，研究 了光照强度对其生殖行为的影响，并对细叶百合(厶Jp衄jJ砌)进行生殖生态学方面的研究。 植物园龙雅宜等(1999)也对北方资源进行收集，并在资源利用与商品化栽培上进行了 探索。云南大学虞鸿等于1999年开始进行了云南野生百合的引种驯化工作，对抗性强、观赏 价值高的泸定百合、紫斑百合(厶刀印昂』鲫sP)进行了群体间的形态学与染色体核型变异研究 (虞泓等，2000)。赵等对秦巴山区野生百合种质资源调查，在广泛研究的基础上，针对 某些种质提出了合适引种栽培措施，筛选出适宜的栽培条件，如引种驯化成败的关键是选择5两南大学博十学位论文适宜的栽培地点，不同种类对光照的要求有差异，如岷江百合、川百合、绿花百合(￡．脚sjj)喜在半阴条件件下，而山丹则要求阳光充足(赵等，2005)。虽然我国的百合资源研究工 作已有20几年历史，但是存在延续时间不长、研究种类少等问题，且多数引种工作由于多种 原因现已中断。研究内容也局限在栽培驯化上，受当时条件，资源遗传背景、遗传关系 往往未引起重视。1．3．2．3繁育方法研究百合属植物为蒴果，背裂，种子扁平， 具翅。人工繁殖多以无性繁殖为主，如鳞茎扦插， 自然条件下靠种子繁殖和小鳞茎分株繁殖， 繁殖率较低。探索最佳繁殖方法对资源有效利用 与十分重要。有性繁殖P-玛海莆瓦里指出．百合有子叶出土速生型种子、子叶出土迟发型种子和子叶留 土迟发型种子三种类型，张教方(1994)、孙晓玉(2003)、杨利平(2000，2002)和何丽萍 (2010)曾先后对毛百合、条叶百合、细叶百合、泸定百合的种子萌发特性进行过研究。结 果表明种源地、采收部位、贮藏条件和萌发条件等对种子萌发有明显影响。毛百合属子叶留 土，迟发型种子，种子萌发率呈现出随纬度降低萌发率递减的趋势。细叶百合与毛百合处于 果序下部的种子萌发好于上部，同一果实内中部的种子萌发最好，储存一年后种子萌发力没 有明显变化，株龄相同的野生种与栽培种，种子萌发条件有所差别。百合种子萌发的最佳温 度为20℃～25℃(张教方，1994；杨利平2000)，温度过高或过低都会影响种子萌发，毛百合种子萌发温度上限为35℃，下限为10℃，条叶百合三．c口胁z删在5℃萌发率很高，20℃和20℃～30℃的变温条件泸定百合种子萌发时间最短，GA3可明显促进泸定百合种子萌发， 提高萌发率。影响百合种子萌发的因素除温度外还有光照，光照对有斑百合三．cD刀cD砌·v韶 p“纪办P舭聊、毛百合和川百合均有明显的促进作用(张敦方，1994)，光温的合适组合可明显缩短种子萌发时间，温度、光照等因素对百合种子萌发有明显影响，但本身原产地和 生物类型决定了哪一种因素起决定性作用(杨利平，2000)。由于百合种子繁殖过程中常出现 畸形花和败育现象，且周期很长，所以生产实践中应用较少。无性繁殖百合无性繁殖主要有小鳞茎分株繁殖、鳞叶扦插和组织培养三种方式。小鳞茎 分株方法要求种球数量大，繁殖系数低，对于一些稀有资源不太适合。而鳞叶扦插和组织培 养因对种球需求量较少，成为了百合无性繁殖的常用方法。鳞叶扦插鳞叶扦插是是中国百合繁殖的传统方法之一。鳞叶扦插操作简单，繁殖系数 高，成本低，是百合种质资源保存的常用方法，已有400多年历史(张炜茹，2008)。国内开 展过的百合鳞叶扦插研究多见于栽培百合，野生种研究较少，仅见于毛百合(张敬方，1994)、 细叶百合(杨利平，2001)和青岛百合(赵宇，2007)，杨利平对细叶百合的研究发现，影响细 叶百合扦插效果的最重要的2个因子是温度和光强，25℃避光条件下最适合鳞茎叶扦插，6第一章文献综述相同条件下，外鳞叶和中鳞叶的小鳞茎发生率好于内鳞叶，基质对鳞叶扦插几乎无影响。而 赵宇(2007)对青岛百合的研究结果表明，温度是影响青岛百合生根和生小鳞茎的最重要的 因素，其次是基质，鳞叶几乎无影响。而影响毛百合鳞叶扦插的最重要的因素是鳞叶重 量。可见，就鳞叶扦插而言，不同种对同一因子的要求是有差异的。组织培养1957年百合离体快繁技术取得突破性进展，R0bb首次用百合鳞片出小鳞 茎，此后该项技术日趋完善，现在百合组培方法已多达40余种(蒋细望，2004)。在培养基 选择，外植体筛选、激素配比、分化等方面的文章也较多，普遍认为MS培养基适合于小 鳞茎增殖，在鳞叶位选择上，下部要好于上部，鳞茎中心部位鳞叶要好于外侧鳞叶。选 择时间上看，春季最佳，夏季次之，秋、冬季节最差，培养基中蔗糖浓度为10‰结鳞茎效 果最佳，10mg／L多效唑对鳞茎形成有明显促进作用，低温处理鳞叶可促进小鳞茎分化。除此 以外，培养基中激素浓度变化对组织分化也有明显影响，在外植体选择上，以鳞茎分化效果 最佳，选用花器官作为外植体时，在培养基激素配比，灭菌时间上与鳞叶有明显不同，花器官中，以花梗分化效果最佳。0．01mg／L多多效唑有促进生根和壮苗作用。历经多年探索，百 合组织培养技术已将在种质资源、脱毒苗培育等方面取得明显效果，然我国百合组织培 养技术多用于栽培品种，已开展的野生百合研究较少(表1．1)，在外植体选择上，以鳞叶居多。1．3．2．4遗传多样性研究遗传多样性也称基因多样性，是生物多样性的基础(李俊清，1994)，是指种内基因的变 化，包括种内显著不同的种群间和同一种群内的遗传变异(马克平，1993)。遗传多样性均发 生在水平上，遗传信息在和内部因素的作用下，在复制过程中出现了诸如DNA片段 倒位、易位、缺失或转座等差错，从而导致了不同程度的遗传变异。自然界中存在的变异是 突变的积累，经过漫长的漂变和自然选择，突变得到了固定或消失，成为间和内的 丰富的遗传多样性。的遗传变异越丰富，对变化的适应性就越强，遗传多样性低的 其在进化上的适应能力较弱，的消失或往往伴随着遗传多样性的降低或消失， 即群体内的遗传变异反映了的进化潜力(Solbrig Q T，1991)。遗传多样化性主要表现为形态多样性、蛋白质多样性、染色体多样性和DNA多样性。形态多样性往往依据稳定的形态性 状，借助数量分析方法对多样性进行分析。蛋白质多样性一般是通过氨基酸序列分析，同工 酶或等位酶电泳分析等两种方法检测。染色体多样性通过主要通过染色体数目、组型及 时的行为等进行分析。DNA多样性主要通过各种标记技术进行分析。检测遗传多样性的 方法很多，每种方法都能提供一些有价值的信息，然各种方法都各有其优势和局限性。随着 生物学的快速发展，遗传多样性的研究方法已经不再停留在形态学、细胞学和生理生化 水平，而是发展到以DNA标记为主的生物学水平。大量的研究证明遗传标记技术已经成 为检测植物资源遗传多样性的有效技术手段之一，高的遗传多样性是适应7西南大学博士学位论文表1．1组培成功的我国野生百合7I’2Ible 1．1 Species ofwild Lily in China succeeded tO be cultIlred与进化的基础，种内多样性是以上各水平多样性的来源。 形态多样性我国百合属植物生境多样，生态类型丰富，形态水平上的遗传多样性丰富。利用形态标记研究百合的形态多样性已经在野生资源和栽培种研究中开展。野生种研究主要集中在紫斑百合(何显静，2003)、泸定百合、川百合(何显静，2003)、宝兴百合(何显静， 2003)、毛百合(刘祥军，1992)、卷丹(何显静，2003)等资源。何显静对云南紫斑百合、 泸定百合、川百合、宝兴百合、卷丹5种7个类群17个形态性状进行统计分析，结果表明17 个性状都有多样性，卷瓣组种间差异明显，紫斑百合变异主要存在于居群内个体间，川百合和紫斑百合居群内变异丰富。刘祥军(1992)对毛百合、山丹、渥丹、垂花百合厶cP聊“删和朝鲜百合三．册幻如幼苗形成过程的研究表明，毛百合和山丹种子结构基本相同，幼苗结构 相差不大，但形成过程不同，东北百合与毛百合种子萌发过程相近，条叶百合、渥丹、垂花 百合和朝鲜百合与山丹幼苗形成过程相近。荣立苹等(2010)对中国东北地区6种3变种30 分野生材料23个形态性状的数量分类结果显示，基于形态性状30份材料被分成了2类，毛百 合和卷丹聚成l类，第2类包括有斑百合、大花卷丹厶．肠w的厅z册v札聊戗砌口w而谢、大花百 合、细叶百合、垂花百合和东北百合和朝鲜百合。王欣(2007)调查、研究了渥丹百合种内 10个居群茎、叶、花、果实、种子等25个性状，结果表明根据形态分类性状可以将渥丹百合分为变种有斑百合、黄花渥丹三．cD疗∞五v缸cD，zcD肠，．和大花百合三．∞聊^矩vaL m倒伽历z册，8第一章文献综述 有斑百合与黄花渥丹亲缘关系较近，与大花百合亲缘关系较远。栽培百合表型多样性的研究报道较多，张西丽(1992)还究了不同来源的9个品种48个性状，结果将9个品种分为3个系，即，亚洲系、东方系和麝香系。除了宏观的形态性状以外，花粉性状因其保守性也作为 研究系统发育关系迅速且快捷的依据，吴祝华(2007)研究了分布于我国的12个野生种及6 个栽培品种的花粉形态特征，分析结果表明花粉形态特征能准确地进化关系，卷瓣组的 大多数种比百合组的种要进化。染色体多样性百合属植物的染色体研究报道较多，但存在研究的数目过少等问题。 荣丽苹(2009)研究报道了了原产东北的大花百合、卷丹、毛百合、朝鲜百合、大花卷丹f、 有斑百合、细叶百合、垂花百合、东北百合和黄花渥丹等6种3变种1变型的核型，结果表 明只有卷丹是三倍体，其余都是二倍体，毛百合核型类型3 A型，不同于其它种(3B)，核型 分析结果显示卷丹与所研究的其它种亲缘关系较远。霞(2003)研究了岷江百合4个居 群的核型，结果表明，4居群内无染色体数量变异，但存在结构变异和核型多型性。何显静 (2003)从常规染色体水平研究了云南紫斑百合的3个居群，认为紫斑百合群体内存在巨大 的遗传变异，遗传变异水平中等偏上。王欣(2006)等研究了渥丹百合4个不同居群的核型， 发现渥丹百合不同居群染色体结构变异明显。岳玲(2006)还分析了产于辽宁的有斑百合、 细叶百合、朝鲜百合和垂花百合四个的核型，细叶百合核型类型不同于其它3种。说明 细叶百合与有斑百合、朝鲜百合和垂花百合的亲缘关系较远，而其余三者亲缘关系较近。刘 光欣还用GiemsaC．带分法级荧光原位杂交法对岷江百合、渥丹百合和泸定百合的根尖染色体 进行了研究。经过多年研究，已经对百合属植物的染色体数目、核型特征基本清楚，诸多的 研究结果表明，我国百合天然居群存在着一定程度的遗传变异，这些变异往往对进化是 有利的。但是我国目前只开展了百合属少数种的染色体研究，就百合属的系统发育研究而言， 研究数目过少、内容上过于片面，缺乏系统性和全面性。另外，研究手段上过于传统， 新的技术应用较少。蛋白质多样性酶电泳技术在系统与进化中的应用始于上世纪70年代(葛颂，1994)。等 位酶分析方法是系统学研究方法的一种，是生物化学与生物学不断发展的产物，已 成功用于多个的遗传变异和亲缘关系分析(葛颂，1994；王中仁，1996)。我国百合资源 同工酶和等位酶研究方面报道不多，姚青菊(2007)研究了岷江流域王百合、通江百合2种 18个样品多酚氧化酶同工酶，结果显示两个种间同工酶谱带差异明显，聚类结果可将两种明 显分开，两个种群体间和群体内均存在一定程度的变异。周厚高(1999)采用9个等位酶的 14个基因位点，研究8个百合品种的遗传组成，并探讨品种间的亲缘关系。孙晓泽(2007) 对沈阳地区东方百合11个品种的可溶性蛋白，过氧化物酶(PoD)、酯酶(EsD、超氧化物歧 化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)等同工酶进行了研究，分析结果显示品种间存在丰富的遗传多 样性，分析结果可为今后遗传育种提供依据。谢树贵(2009)研究了沈阳地区5个百合品系9西南大学博七学位论文 44个品种的同工酶遗传多样性，统计分析结果表明东方百合与野生百合亲缘关系最远，日本百合与野生百合遗传相似度最大，亲缘关系最近。DM多态性研究目前国内百合DNA多态性研究主要利用的是DNA标记技术，利用 的标记技术主要有RAPD、ISSR和AFLP技术。研究内容主要集中在以下几个方面：1． 群体遗传结构分析，何显静(2003)以云南的的紫斑百合3个居群为研究对象，开展了形态 性状、常规染色体性状以及ISSR三个层次的研究，ISSR分析结果表明紫斑百合种群遗传多样 性较高，变异主要保存于居群内部。毛钧(2003)采用RAPD标记技术研究了云南泸定百合 普洱居群的遗传与变异，结果表明普洱居群的遗传变异水平较高。2百合资源群体遗传多样性 及亲缘关系分析，在百合资源研究中，凡气PD这一标记技术应用较多，左志锐(2005)、 张克中(2006)、陈郦俊(2009)、荣丽苹(2009)、童巧珍(2010)先后采用此项技术对中国 百合资源进行了研究，左志锐分析了野生种及栽培品种共60份材料，验证了部分栽培品种与 野生种的亲缘关系，东方百合及铁炮系百合与野生种的亲缘关系较近，聚类结果与材料的起 源演化一致。张克中研究了野生百合的25份种质，RAPD聚类结果与形态分类结果大致吻合， 但是钟花组部分种与卷瓣组的大部分种聚在一起，说明钟花组与卷瓣组存在基因交流。荣立 苹研究了东北地区野生百合6种3变种24份试材的遗传多样性，结果表明野生百合具有较高 遗传多样性，细叶百合与垂花百合亲缘关系较近，卷丹与有斑百合亲缘关系较近，而与同为 卷瓣组的大花卷丹、细叶百合、朝鲜百合等亲缘关系较远。童巧珍(2010)研究了16份百合 种质，聚类结果显示百合属和大百合属很自然地分成两类，聚类结果还表明遗传距离与地理 距离存在一定的相关性。陈郦俊研究了21份野生种和24个栽培品种45份种质，聚类结果能 够很好地将野生种与栽培品种的不同系别区别开来，源于统一地区的野生百合聚成l类，说 明同一地区的野生百合具有较大的遗传相似性，呈现一定的地域特征。张克中还利用AFLP 技术分析了东北地区野生百合24份种质的亲缘关系，聚类结果与形态分类结果基本吻合，但 是钟花组部分种质与卷瓣组大部分聚在一起，表明卷瓣组与钟花组存在基因交流。此外 DNA标记技术在我国栽培百合的品种鉴定及遗传背景分析方面也有广泛应用。1．3．2．5传粉生态学研究传粉生态学起源于Spemgel，DnⅣin等的博物观察，至今已有200多年的历史(郭友好， 1994，2000；张大勇，2004)，传粉生态学主要研究种子植物的花粉从雄蕊运动到雌蕊的过程， 以及此过程与条件的关系及传粉后果。百合属植物的传粉生态学研究相对较少，已有的 研究报道主要集中在花粉的形态和生理上。杨利平(1998)初步观察分析了百合属10种植物 的自花传粉和种间传粉，发现轮叶百合、有斑渥丹、王百合、毛百合白花不孕，川百合和条 叶百合同株异花传粉的亲和性好于同花传粉的亲和性，同为钟花组的毛百合和有斑渥丹正、 反交均不座果，常规条件下种间授粉的亲和性与形态上的亲缘关系并不一致。王欣(2007) 研究了渥丹百合10个居群的花粉颜色、形状、大小、外壁纹饰和生活力，结果表明依据形态10第一章文献综述 分类性状渥丹百合可以分为变种有斑百合、黄花渥丹和大花百合，有斑百合与黄花渥丹亲缘关系较近，与大花百合亲缘关系较远。孙晓梅(2002)、罗凤霞(2005)对部分栽培百合研究 表明，不同授粉方法对百合杂交结实力影响不同，花发育时期及亲本组合对杂交结实影响很 大，培养液处理花粉对杂交结实普遍有促进作用，Nacl溶液处理和6．BA处理效果不明显。 丁彬(2006)发现Nacl溶液处理对百合花粉萌发有作用。罗凤霞(2005)发现储藏温度 对花粉生命力影响很大，一18℃保存有利于促进百合生命力，4℃次之，常温最差。1．3．2．6遗传育种研究野生百合具有优良的性状，是提高百合抗性和观赏性状的重要基因来源，是百合育种的 理想亲本。我国野生百合种类丰富、生态类型多样，作为亲本曾经为世界百合育种事业做出 过突出贡献。黄济明于上世纪80年代开展了野生百合之间的杂交育种工作，以麝香百合为母 本，百合为父本育成了麝兰，获得了毛百合与细叶百合的具杂交胚的种子。90年代以来， 先后开展过毛百合与细叶百合，细叶百合与垂花百合，轮叶百合与王百合，条叶百合与岷江 百合的种间杂交工作，事明野生种之间的杂交种远不及商品种，形态分类上的亲缘关系 与生殖亲和力不符。然商品百合遗传背景复杂，品种间杂交很难获得优势的组合，利用杂交、 回交等方法，将野生种的优势基因渗透到商品种中去，是百合育种的主要方向之一。另外探 索克服花粉远缘杂交障碍的方法，建立有效地技术体系也是百合育种工作的目标之一。纪海 珊(2002)通过体外胚珠授粉实验发现，认为胚珠与花粉间最适授粉距离是1mm，花粉管穿入 胚珠所需时间早于精子形成时间是百合体外胚珠授粉法失败的主要原因。百合杂交育种中杂 种胚与胚乳不亲和，往往造成杂种胚的早期败育(于小英，2000)，杂种胚的离体培养是获得 远远杂交杂种植株的有效方法之一(王亚彬，2003；屈云慧，2002；孙晓梅，2002)。诱变育 种可以创造不同的种质(林祖军等，2002)。张克中(2002)通过诱变育种研究，发现王百合 在辐射诱变过程中染色体结构和数量发生了变异，造成了花粉畸变直至败育。辐照后，亚洲 百合减数的染色体数目和结构出现了明显的变异(陆长旬，2002)。采用辐照花粉辅助授 粉能克服百合与毛百合杂交障碍，提高了饱满种子的结实率(贾月慧，2010)。随着基因工程 的发展，我国学者相继在百合高频再生遗传系统建立(刘菊华，2003)、受体系统建立(余 桂红，2004)等方面取得了一定的进展。另外，通过多倍体育种不仅能提高百合的观赏和食 用价值，还能克服远缘杂交障碍，有利于培育新的百合品种(陆春霞，2009)。黄济明等用组 织培养与化学诱变相结合的办法培育出了我国百合的第一个多倍体。此后连雪斌(1995)、张 兴翠(2003)、郑思乡(2004)、何林(2006)等先后以气培、秋水仙素处理等方法获得了兰 州百合、药用百合和东方百合的多倍体。国外学者在百合细胞工程育种和标记辅育种取 得了一定，这将推动我国百合的育种事业奠定基础。1．3．2．7次生代谢产物提取及药理作用研究百合为食药两用植物，为百合科球根植物的总称，性味甘寒，养阴润肺，清心安神，用11两南大学博士学位论文于阴虚久咳，痰中带血，虚乏惊悸，失眠多梦，等症(中华人民国药典，2005)。《神农本草经》最早记载其“味甘、平，主治腹胀，心痛，利大、小便，补中益气”。．百 合鳞茎富含淀粉、蛋白质、钙、磷、铁、维生素等营养成分，还含有酚酸类、皂甙类、多糖 类等特殊的营养成分，这些不仅使百合具备良好的滋补功效，还具有美容养颜、防癌、抗癌 的功效。国内在百合化学成分分离、分析及药理作用方面的研究较多，中药百合不仅含有生 物碱、皂苷、磷脂、多糖等活性成分，还含有淀粉、蛋白质、氨基酸和各种维生素、矿物质 (曲伟红，2004)。杨秀伟从卷丹中分离得到两种化合物，其中一种为新化合物。胡文彦(2007) 分离得到卷丹的13种化学成分，其中10种在百合属植物中首次发现。何纯莲(2003)测得 卷丹鳞叶中秋水仙碱的含量为6．40％，秋水仙碱临床上可以用于癌症的预防和治疗(倪武，1998)，还可用于原发性通风的治疗(S鹕等，1989)。李新华(20lO)通过研究百合多糖对小鼠免疫功能的影响，发现百合多糖能够提高小鼠的性或非性免疫功能。百合多糖 还有增强抗疲劳药理功效(何纯莲，2009)。研究还证明百合多糖具有增强抗缺氧能力、抗氧 化能力和提高免疫力作用(胡敏敏，2007)。1．3．3我国野生百合资源面I临的问题及应对措施百合集观赏、食用、药用于一身，自古深受世界人们的喜爱。我国是百合的自然分布中 心之一，也是栽培和应用百合历史最久的国家之一(赵，2000)。尽管文献资料显示我国 有着丰富的百合资源，但作者在最近几年资源收集研究过程中发现，我国野生百合资源正面 临着极大的危机，一些种已被列入《中国植物红皮书 稀有濒危植物》，如墨江百合、紫斑百 合、乡城百合、开瓣百合等，百合资源的与刻不容缓，引起百合资源递减的有原因 有两种，一种是生物因素也就是自然原因造成的，另一种是人为因素。自然因素我国野生百合大多处于自然生长的野生状态，自然状态下百合生长在山坡灌丛 下、向阳草坡或山沟，河边，高山草地或疏林下，生长基质一般疏松、排水及通气良好，多 为富含腐殖质的微酸性或崖壁、岩石缝隙中(田爱梅，2007)，生境多贫瘠，在与周围植 被争夺空间时，野生百合往往处于劣势。另一方面由于自然下百合本身更新速度缓 慢，种子繁殖、珠芽繁殖、鳞茎分株繁殖是自然生长的百合繁殖的主要方式，种子低萌发率 及珠芽较低的成活率，鳞茎分株的较低的繁殖系数，造成了本身天然更新进程的过慢， 致使分布分散，种群规模缩小。人为因素引起百合资源递减的人为因素很多，如公、铁建设、旅游开发、土地开垦、 过度放牧等所造成的百合生境的。受经济利益盲目的野生种球收集、采挖。外来商 业种球的大量引进所带来的病虫害。气候变暖、物理、化学污染所造成的直接，总 之，人类直接或间接的活动使百合资源受到严重，有些甚至是性的。应对措施：1．加强百合资源调查、收集和工作，建立种质资源圃。2．针对珍12第一章文献综述 惜濒危在离体保存的同时尽快实现资源快繁，建立长效的机制，设立濒危区，对一些生境严重的，可实施迁地。3．科学引种、科学驯化，依托研究机构，建立科学繁育体系的同时，逐步提升栽培技术。4．利用新兴生物学技术构建遗传图谱，掌 握资源的遗传背景、亲缘关系，开展抗性生理研究，选育优良的育种亲本。5．加强群落生态学、 生物学方面的研究。13两南大学博士学位论文14第二章引言第二章引言2．1研究背景、目的和意义百合是指百合属的各个种及品种的总称，是世界5大鲜切花之一，界鲜切花市场中 占有极其重要的地位，百合切花生产的飞速发展依托于先进的育种技术。在百合品种改良过 程中，野生资源发挥了极其重要的作用，利用先进的技术将野生资源优良的性状整合到栽培 品种中去，提高栽培品种的抗性和观赏价值一直是育种工作者的目标之一。我国野生百合具 有优良的抗性，是百合育种的重要基因资源，曾经为百合育种做出过突出贡献，现今世界各地普遍栽种亚洲百合杂种系(彳s脚曲，．泌人东方百合杂种系(伽P玎而酣缈6厂fc泰)、麝香百合杂种系(幻彬，删^啪r胁)、喇叭百合杂种系(m唧甜局，6r泌)等均有我国原种杂交而成，依托于野生百合(如岷江百合)的抗逆性，20世纪初，一度濒临的欧洲百合得以重 现生机。作为百合属的自然分布中心，中国原产百合55种(傅立国，2002)，占全属资源的 的47．8％(55／115)，这为培育具有自主知识产权的品种奠定了资源基础，然而由于诸多原因， 我国的百合育种水平始终落后于欧美，花卉生产所需种球主要依赖于进口。随着经济的增长 和人们物质文化生活水平的提高，一方面百合切花市场需求逐年增加，另一方面百合生产所 需种球大量依赖于进口，如此往复循环，致使在一些地区出现了盲目采挖野生资源的现象， 很多地区滥采滥挖现象、百合资源严重，很多珍贵种已经濒临。深入全面地了 解我国野生百合种质资源，建立长效的利用与机制已势在必行，早期的研究表明种间授 粉的亲和性与基于形态性状的亲缘关系并不一致(杨利平，1998)，而系统学是以核酸 为研究对象，分析结果更加接近于类群的亲缘关系。因此本研究利用SRAP和AFLP两种分 子标记技术，分析、了解我国野生百合资源的遗传多样性及亲缘关系，希望为实现种质创新、 提高我国百合育种水平、促进资源合理利用及系统学问题解决提供参考。2．2研究内容及技术线．野生百合遗传多样性及亲缘关系的SRAP分析2野生百合遗传多样性及亲缘关系的AFLP分析3．通江百合遗传多样性的SRAP分析2．2．2研究设想及技术线百合花姿雅致，叶片青翠娟秀，茎干亭亭玉立，花色鲜艳，是盆栽、切花和点缀庭院的名 贵花卉(陈俊愉，1999)。中国为百合属的自然分布中心之一，百合种类资源丰富，曾经一 度为国外学者所关注。野生百合曾经为世界百合育种作出过突出贡献，而我国自主知识产权15西南大学博士学位论文 的品中极少，百合生产种球大量依赖于进口，百合育种水平大大落后于欧美国家。了解我国野生资源的特点对于优良育种亲本的选择具有极其重要的意义。我国百合资源研究起源于上世纪80年代，虽然已有数十年历史，然以往研究多集中于区域性的资源调查，收集，区域性 的遗传多样性的研究，缺乏对我国资源的全面了解，已报道的标记研究存在研究数 目过少、缺失关键组数据等问题。另外在系统学研究上，虽然Comber系统仍然是现今普遍 采用的分类系统，但长期以来百合属下类群划分、起源、进化、迁移等问题争议颇多，围绕 钟花组、卷瓣组设立、组的界定范围等的争论尤为激烈，本研究采用通过S＆廿和AFLP两种分 子标记技术，以我国野生野生百合为研究对象，对我国百合的遗传多样性及亲缘关系进行分 析，望为遗传育种及系统学问题探讨提供借鉴。技术线第三章野生百合亲缘关系的SRAP标记第三章野生百合亲缘关系的SRAP标记SRAP是美国大学的Li和Quiros于2001年提出来的，是一种无需任何序列信息即可 直接PCR扩增的标记技术。SRAP通过一对引物对OI冲(阅读框open Reading F姗)进行扩增，正向引物17个碱基，对外显子区域扩增，反向引物18个碱基，对内含子区域、 启动子区域进行性扩增，个体不同及内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态 性，具有操作简便、产率中等、重复性好、多肽性高、高共显性、引物通用等优点。目前已 成功应用于植质资源鉴定、亲缘关系分析、基因定位、遗传图谱构建等领域。3．1材料与仪器设备3．1．1试验材料于2005年始，作者开始收集中国野生百合。收集到的用于本实验的试材为中国百合23 个野生种，来源及基本特征见表3．1，部分试材生境照片见图3．1。试材涉及中国百合全部4 个组，于野外取幼嫩叶片低温带回实验室，液氮冷冻后．70℃保存备用，或引活体材料栽培于 花卉工程技术研究中心种质资源圃，同时建立所收集材料的离体快繁体系，以备DNA 提取之需。所有供试材料均经过形态学鉴定。3．1．2试剂及仪器设备试剂CTAB，PVE氯仿异戊醇，NaCL， KCL，，异丙醇，95％乙醇，TE，10×PCR bu妇fer，dntp，M孑+，loo％乙醇，琼脂糖，6×LDdding bu位r，DL2000，1’AE，6×loadding bu妇衙。 仪器设备超低温冰箱，研钵，低温冷冻离心机，恒温水浴锅，台式离心机，DYl『一6C型电泳仪，Bio-rad凝胶成像像统，EppendorfPcR仪。3．2试验方法3．2．1基因组DNA提取选取幼嫩叶片，采用改良CTAB法提取基因组DNA，调整DNA浓度至100 ng／止，一70℃保存备用。3．2．2引物筛选以分别隶属于百合属四个组的四种植物，野百合、毛百合、川百合、青岛百合基因组DNA 为模板，采用优化后的PCR体系，对合成的引物进行筛选，选择在四个组中均有良好多态性 的引物用于后续百合属植物遗传多样性检验及亲缘关系分析。17两南大学博+学何论文表3．1本研究所用试验材料来源Table 3．1 Origins of materials used in the present study第二三章野生百合亲缘关系的sRAP标记w¨把．14．百合厶扣啊删^啪云南昆明K岫咖n舀ⅥI蚰舳引种栽培．m喊耐cIlIⅧ耐叶敲生．花喇叭形，花被片先端反卷．L^w3 9∞n目ed．肋wm艄l呷dlike，t印als’q姗t晕s f啪IlIte．青岛百台L埘噌血l㈣Ie野生wiId叶轮生，花橙或橙红色．Ln悄whoded，dow∞oⅢ骠yelloworOr¨ge_md．16-攻红百合L彻螂哪啪云南昆明Kl删衄噱Ⅶ蛐¨引种栽培岫喊。dcIllⅦ嘲钟花组S∞L厶呻。坤。州_叶敲生。花冠钟形．紫红色。下垂．L—ws删盯一，。omU童bdl曲单ed。pl耵一e a埘pendulout重庆金佛山冰．m南，Cbon矾ing叶救生。花下垂．白色或粉红色。反卷．Laws训ered．noⅧp油Ious’whitcorp讪kandf啪lut‘lB．卷丹厶蛔咖Am重庆城口ch∞如u，cho嘲ing野生词d叶敲生．具珠芽。花下垂，橙红色．【∞Ⅷ9％tk同。h咖g blIIb氓nowe体pendulou3&nd o珊誉坷d．东北百合L d细目晴姗辽宁沈阳sk哪柚喜u∞ni岵引种栽培in帆IdI．c。d cuh吣一轮叶组s∞t．埘l一4窖∞叶中邮轮生。少数教生．花渍橙红色．花被片稍反卷．M试mele_mw量IotIed，-白w辩¨删，矗ow曩3 lighdy onn簪州，t叩do-linlen}ⅦIu咄20．野百合上-如埔盯野生wild叶散生。花乳白色，喇叭形．花被片先蛸外弯．tnⅦs目m∞ed，nomnmil时曩bd蚋唧etlik‘‘单d。，0p舶tips o埘wl—k21．川百合L面砌j四川康定l(an—ilI蓦Sichu蚰野生w沁叶教生，花下垂，橙红色．花被片反卷．【aws∞嘣e喇，dowenp曩-dIl_lous Ind o舢霉e-red．t单d8 re忡lut‘22．大理百合厶瑚哪B重庆金佛山Muin旬．chon嗣洫g野生wild叶散生·花下垂．白色．花被片反卷．L篇wl删e∞dno邺p∞dulo惦Bnd w址te妊pds reWIme‘23淡黄花百合L JH恸埘蝴重庆金佛山MtIJin向．am嘲ing野生wild叶散生·具珠芽。花白色．喇叭形。咯下垂．【nv目删ered．h¨ingbum柚s丑ow口j讲血c矗喇岫ImpetIik矗Ii山ependlII吣百合L出诚僦 w 甘肃C’岫小u．LIn出∞引种栽培in蛐。d cIlI垤ted卷瓣组s∞L岛帕肿口哺喀硼叶散生。花下垂．橙红色．花被片反卷。l—ws吲In蛐一，丑。邺ⅧⅡ‘栅a肋^pl锄如_lous a丑d onn窖e_耐，t印ms r掌帅Iutc．披针叶百合L州mI妇Im m 重庆垒佛山ML抽白．Cho嘲i地野生硼d叶敲生。披针形。花下垂．橙、绿白色或白色。花被片反卷．L∞moc^—“鬻l啊∞叭酬_耐t-∞∞lAk丑I州m徊Iow．雕蚰-w咄c or w响e aIld．t印柚sre、DIut巴·本研究试验材料组别划分参照t中国植物忠》‘The s∞d帆of m删aIs used in the p∞∞眦啦l-dy、№他divided a∞砌i赡坩Bom ofCK髓西南大学博士学位论文 图3．1部分实验材料图片ig 3．1 The picture of some spiecies ofLf疗“肌f．or reseach(四川、康定)and the cllalplet of￡．如v触f(Kangding，Sichuan)第三章野生百合亲缘关系的S鼬廿标记2．岷江百合生境(四川、茂县)2．111e gro叭h s“mtion of￡．心弘彪(MaoXia玛Sichmn)3．南川百合生境及花冠(重庆、金佛山)3．The伊。叭h situation and the chalplet of￡．，∞腑D聊f玎Mtjinfb，Chongqin曲2l西南大学博士学位论文4．毛百合花冠4．1k chalplet of厶妇“廊踟5．湖北百合花序5．1k inflorescence of￡．^朋删6．大理百合生境及花冠(重庆、金佛山)6．The gr0吼h sit吼tion and the chalplet of￡．，口如刀5P(Mt．jinfb，Chongqin曲第三章野生百合亲缘关系的S凡廿标记7．通江百合花冠及生境(重庆、金佛山)7．m growm situation and me cbalplet of￡．s口僻，zff口P(Mtjinfo，chongqin曲8．淡黄花百合生境(重庆、金佛山)8．The gr0叭h situation of￡．s“枷“陀蜊 (Mt．j曲fo，Chongqing)23两南大学博士学位论文9．青岛百合花冠9．T11e chalplet of￡．黯垤f口“P厅Je第三章野生百合亲缘关系的S凡廿标记10．宜昌百合花冠(重庆、城口)l O．ne chalplet of￡．彪Hc册历姗(Chengl【吣chongqing)11．野百合花序1 1．The inflorescence of￡．6，-0¨税矗25西南人学博士学位论文12．宝兴百合生境及花冠(重庆金、佛山)12．111e gro嘶h situation and the cbalplet of上．如c^口r抛f(Mtjir面，Chongqing)第三章野生百合亲缘关系的SRAJP标记13．条叶百合13．L．c口盯∞堋t’‘～≯。‘}鼍趟焱～～／《Z》≤孓。、。弋￡一，夕￡ 蔷≮＼一14．111e innorescence锄d the chalplet of厶∞以cD如r27西南人学博士学位论文15．百合花冠1 5．111e cllalplet o￡￡．妇’，砌f Var“咒fc如厂cDffDn3．2．3引物最佳退火温度筛选以通江百合为模板，37℃为基准温度，±0．5℃为梯度，采用梯度PCR扩增摸索已筛选 出的引物的最佳退火温度。3．2．4 PCR体系及扩增引物设计参照Li(“G，Q咖s C．F．，2001)，由上海英俊公司合成，引物序列见表3．2。从144对引物中选择19对多态性高，重复性好的引物用于PcR扩增。25止反应体系中，含l×bu脑，2．5删矿+、2．
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